biologia
biochip
Nella biologia molecolare, i biochip sono essenzialmente laboratori miniaturizzati che possono eseguire centinaia o migliaia di reazioni biochimiche simultanee. I biochip consentono ai ricercatori di selezionare rapidamente un gran numero di analiti biologici per una varietà di scopi, dalla diagnosi della malattia al rilevamento di agenti di bioterrorismo. I biochip microfluidici digitali sono diventati una delle tecnologie più promettenti in molti campi biomedici. In un biochip microfluidico digitale, un gruppo di celle (adiacenti) nell'array microfluidico può essere configurato per funzionare come immagazzinamento, operazioni funzionali, nonché per il trasporto dinamico di goccioline di fluido.
Storia
Lo sviluppo è iniziato con i primi lavori sulla tecnologia dei sensori sottostante. Uno dei primi sensori portatili a base chimica fu l'elettrodo pH in vetro, inventato nel 1922 da Hughes. Negli anni successivi. Ad esempio, è stato prodotto un sensore K + incorporando la valinomicina in una membrana sottile.
Nel 1953, Watson e Crick annunciarono la loro scoperta dell'ormai familiare struttura a doppia elica delle molecole di DNA e gettarono le basi per la ricerca genetica che continua ancora oggi. Lo sviluppo di tecniche di sequenziamento nel 1977 da parte di Gilbert e Sanger (lavorando separatamente) ha permesso ai ricercatori di leggere direttamente i codici genetici che forniscono istruzioni per la sintesi proteica. Questa ricerca ha dimostrato come l'ibridazione di singoli filamenti di oligonucleotidi complementari potrebbe essere utilizzata come base per il rilevamento del DNA. Due ulteriori sviluppi hanno consentito la tecnologia utilizzata nel moderno DNA-based. Innanzitutto, nel 1983 Kary Mullis ha inventato la tecnica di reazione a catena della polimerasi (PCR), un metodo per amplificare le concentrazioni di DNA. Questa scoperta ha reso possibile il rilevamento di quantità estremamente ridotte di DNA nei campioni. In secondo luogo, nel 1986 Hood e collaboratori hanno ideato un metodo per etichettare le molecole di DNA con etichette fluorescenti anziché radiomarcate, consentendo così di osservare otticamente gli esperimenti di ibridazione.
La Figura 1 mostra la composizione di una tipica piattaforma di biochip. Il componente di rilevamento effettivo (o "chip") è solo un pezzo di un sistema di analisi completo. La trasduzione deve essere eseguita per tradurre l'evento di rilevamento effettivo (legame al DNA, ossidazione / riduzione, ecc. ) In un formato comprensibile da un computer (tensione, intensità della luce, massa, ecc. ), Che quindi consente ulteriori analisi ed elaborazione per produrre un output finale leggibile dall'uomo. Le molteplici tecnologie necessarie per realizzare un biochip di successo - dal rilevamento della chimica, al microarraying, all'elaborazione del segnale - richiedono un vero approccio multidisciplinare, rendendo la barriera all'entrata ripida. Uno dei primi biochip commerciali è stato introdotto da Affymetrix. I loro prodotti "GeneChip" contengono migliaia di singoli sensori di DNA da utilizzare per rilevare difetti o polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), in geni come p53 (un soppressore del tumore) e BRCA1 e BRCA2 (correlati al carcinoma mammario). I chip sono prodotti utilizzando tecniche di microlitografia tradizionalmente utilizzate per fabbricare circuiti integrati (vedi sotto).
Fabbricazione di microarray
Il microarray - la densa griglia bidimensionale di biosensori - è il componente critico di una piattaforma di biochip. Tipicamente, i sensori sono depositati su un substrato piano, che può essere passivo ( ad esempio silicio o vetro) o attivo, quest'ultimo costituito da elettronica integrata o dispositivi micromeccanici che eseguono o aiutano la trasduzione del segnale. La chimica della superficie viene utilizzata per legare in modo covalente le molecole del sensore al supporto di substrato. La fabbricazione di microarrays non è banale ed è un grande ostacolo economico e tecnologico che potrebbe alla fine decidere il successo delle future piattaforme di biochip. La principale sfida di produzione è il processo di posizionamento di ciascun sensore in una posizione specifica (in genere su una griglia cartesiana) sul substrato. Esistono vari mezzi per ottenere il posizionamento, ma in genere vengono utilizzati sistemi di micro-pipettaggio o micro-stampa robotizzati per posizionare piccoli punti di materiale del sensore sulla superficie del chip. Poiché ogni sensore è unico, è possibile posizionare solo pochi punti alla volta. La natura a bassa produttività di questo processo comporta costi di produzione elevati.
Fodor e colleghi hanno sviluppato un processo di fabbricazione unico (successivamente utilizzato da Affymetrix) in cui una serie di passaggi di microlitografia viene utilizzata per sintetizzare in modo combinatorio centinaia di migliaia di sensori di DNA a singolo filamento unici su un substrato un nucleotide alla volta. È necessario un passaggio litografico per tipo di base; pertanto, sono necessari quattro passaggi per livello di nucleotide. Sebbene questa tecnica sia molto potente in quanto molti sensori possono essere creati contemporaneamente, è attualmente possibile solo per creare brevi filamenti di DNA (15–25 nucleotidi). L'affidabilità e i fattori di costo limitano il numero di passaggi fotolitografici che è possibile eseguire. Inoltre, attualmente non sono possibili tecniche di sintesi combinatoria diretta alla luce per proteine o altre molecole di rilevamento.
Come notato sopra, la maggior parte dei microarrays sono costituiti da una griglia cartesiana di sensori. Questo approccio viene utilizzato principalmente per mappare o "codificare" le coordinate di ciascun sensore sulla sua funzione. I sensori in questi array utilizzano in genere una tecnica di segnalazione universale ( ad esempio la fluorescenza), rendendo le coordinate la loro unica caratteristica identificativa. Questi array devono essere realizzati utilizzando un processo seriale ( cioè che richiede più passaggi sequenziali) per garantire che ciascun sensore sia posizionato nella posizione corretta.
La fabbricazione "casuale", in cui i sensori sono posizionati in posizioni arbitrarie sul chip, è un'alternativa al metodo seriale. Non è necessario il noioso e costoso processo di posizionamento, che consente l'uso di tecniche di autoassemblaggio parallele. In questo approccio, è possibile produrre grandi lotti di sensori identici; i sensori di ciascun lotto vengono quindi combinati e assemblati in un array. È necessario utilizzare uno schema di codifica non coordinato per identificare ciascun sensore. Come mostra la figura, tale progetto è stato inizialmente dimostrato (e successivamente commercializzato da Illumina) utilizzando perline funzionalizzate posizionate casualmente nei pozzetti di un cavo in fibra ottica inciso. Ogni tallone era codificato in modo univoco con una firma fluorescente. Tuttavia, questo schema di codifica è limitato nel numero di combinazioni di coloranti uniche che possono essere utilizzate e differenziate con successo.
Array di biochip proteici e altre tecnologie di microarray
I microarrays non si limitano all'analisi del DNA; microarray proteici, microarray di anticorpi, microarray di composti chimici possono anche essere prodotti utilizzando biochip. Randox Laboratories Ltd. ha lanciato Evidence, il primo analizzatore di tecnologia Biochip Array Technology nel 2003. Con la tecnologia Biochip Array Technology, il biochip sostituisce la piastra o la cuvetta ELISA come piattaforma di reazione. Il biochip viene utilizzato per analizzare contemporaneamente un pannello di test correlati in un singolo campione, producendo un profilo paziente. Il profilo del paziente può essere utilizzato nello screening della malattia, nella diagnosi, nel monitoraggio della progressione della malattia o nel monitoraggio del trattamento. L'esecuzione di più analisi contemporaneamente, descritte come multiplexing, consente una significativa riduzione dei tempi di elaborazione e della quantità di campione del paziente richiesto. La tecnologia Biochip Array è una nuova applicazione di una metodologia familiare, che utilizza saggi immunologici sandwich, competitivi e per la cattura di anticorpi. La differenza dai test immunologici convenzionali è che i ligandi di cattura sono attaccati covalentemente alla superficie del biochip in una matrice ordinata piuttosto che in soluzione.
Nei test sandwich viene utilizzato un anticorpo marcato con un enzima; nei test competitivi viene utilizzato un antigene marcato con un enzima. Sul legame anticorpo-antigene una reazione di chemiluminescenza produce luce. Il rilevamento avviene tramite una telecamera con dispositivo di accoppiamento di carica (CCD). La telecamera CCD è un sensore sensibile e ad alta risoluzione in grado di rilevare e quantificare con precisione livelli di luce molto bassi. Le regioni di test vengono localizzate utilizzando un modello a griglia, quindi i segnali di chemiluminescenza vengono analizzati dal software di imaging per quantificare rapidamente e simultaneamente i singoli analiti.
I biochip sono anche utilizzati nel campo della microfisiometria, ad esempio nelle applicazioni skin-on-a-chip.
Per dettagli su altre tecnologie di array, consultare Microarray di anticorpi.
