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Peptidi antimicrobici

Peptidi antimicrobici

I peptidi antimicrobici ( AMP ), chiamati anche peptidi di difesa dell'ospite ( HDP ) fanno parte della risposta immunitaria innata che si riscontra in tutte le classi di vita. Esistono differenze fondamentali tra cellule procariotiche ed eucariotiche che possono rappresentare bersagli per peptidi antimicrobici. Questi peptidi sono potenti antibiotici ad ampio spettro che dimostrano il potenziale come nuovi agenti terapeutici. È stato dimostrato che i peptidi antimicrobici uccidono batteri Gram negativi e Gram positivi, virus avvolti, funghi e persino cellule trasformate o cancerose. A differenza della maggior parte degli antibiotici convenzionali, sembra che i peptidi antimicrobici destabilizzino frequentemente le membrane biologiche, possano formare canali transmembrana e possano anche avere la capacità di migliorare l'immunità funzionando come immunomodulatori.

Struttura

I peptidi antimicrobici sono un gruppo unico e diversificato di molecole, che sono divise in sottogruppi sulla base della loro composizione e struttura di aminoacidi. I peptidi antimicrobici sono generalmente compresi tra 12 e 50 aminoacidi. Questi peptidi includono due o più residui caricati positivamente forniti da arginina, lisina o, in ambienti acidi, istidina, e una grande proporzione (generalmente> 50%) di residui idrofobici. Le strutture secondarie di queste molecole seguono 4 temi, tra cui i) α-elicoidale, ii) β-incagliato a causa della presenza di 2 o più legami disolfuro, iii) β-tornante o anello a causa della presenza di un singolo legame disolfuro e / o ciclizzazione della catena peptidica e iv) estesa. Molti di questi peptidi non sono strutturati in soluzione libera e si ripiegano nella loro configurazione finale dopo essere stati ripartiti in membrane biologiche. Contiene residui di amminoacidi idrofili allineati lungo un lato e residui di amminoacidi idrofobici allineati lungo il lato opposto di una molecola elicoidale. Questa anfipatia dei peptidi antimicrobici consente loro di ripartire nel doppio strato lipidico di membrana. La capacità di associarsi alle membrane è una caratteristica definitiva dei peptidi antimicrobici sebbene non sia necessaria la permeabilizzazione della membrana. Questi peptidi hanno una varietà di attività antimicrobiche che vanno dalla permeabilizzazione della membrana all'azione su una serie di bersagli citoplasmatici.

genere caratteristica AMP
Peptidi anionici ricco di acidi glutammici e aspartici Maximin H5 dagli anfibi, Dermcidin dagli umani
Peptidi α-elicoidali cationici lineari mancanza di cisteina Cecropine, andropina, moricina, ceratotossina e melittina di insetti, magainina, dermaseptina, bombinina, brevinina-1, esculentine e buforina II di anfibi, CAP18 di conigli, LL37 di umani
Peptide cationico arricchito per aminoacidi specifici ricco di prolina, arginina, fenilalanina, glicina, triptofano abaecina, apidaecine dalle api mellifere, profenina dai maiali, indolicidina dai bovini.
Peptidi anionici e cationici che contengono cisteina e formano legami disolfuro contiene 1 ~ 3 legame disolfuro 1 legame: brevinine, 2 legami: protegrino di maiale, tachiplesine di granchi a ferro di cavallo, 3 legami: defensine umane, più di 3: drosomicina nei moscerini della frutta

attività

Le modalità di azione con cui i peptidi antimicrobici uccidono i microbi sono varie e possono differire per le diverse specie batteriche. Alcuni peptidi antimicrobici uccidono sia batteri che funghi, ad esempio la psoriasina uccide E. coli e diversi funghi filamentosi. La membrana citoplasmatica è un bersaglio frequente, ma i peptidi possono anche interferire con la sintesi di DNA e proteine, il ripiegamento delle proteine ​​e la sintesi delle pareti cellulari. Il contatto iniziale tra il peptide e l'organismo bersaglio è elettrostatico, poiché la maggior parte delle superfici batteriche sono anioniche o idrofobe, come nel peptide antimicrobico Piscidin. La loro composizione amminoacidica, anfipatia, carica cationica e dimensioni consentono loro di attaccarsi e inserirsi nei doppi strati di membrana per formare i pori mediante meccanismi "pentagramma a botte", "tappeto" o "poro toroidale". In alternativa, possono penetrare nella cellula per legare le molecole intracellulari che sono cruciali per la vita cellulare. I modelli di legame intracellulare includono l'inibizione della sintesi della parete cellulare, l'alterazione della membrana citoplasmatica, l'attivazione dell'autolisina, l'inibizione del DNA, dell'RNA e della sintesi proteica e l'inibizione di alcuni enzimi. Tuttavia, in molti casi, l'esatto meccanismo di uccisione non è noto. Una tecnica emergente per lo studio di tali meccanismi è l'interferometria a doppia polarizzazione. Contrariamente a molti antibiotici convenzionali, questi peptidi sembrano essere battericidi anziché batteriostatici. In generale, l'attività antimicrobica di questi peptidi viene determinata misurando la concentrazione minima inibente (MIC), che è la più bassa concentrazione di farmaco che inibisce la crescita batterica.

Gli AMP possono possedere molteplici attività tra cui attività batteriche anti-gram-positive, anti-gram-negative, anti-fungine, anti-virali, antiparassitarie e anti-cancro. Una grande analisi funzionale AMP indica che tra tutte le attività AMP, l'anfipatia e la carica, due principali proprietà degli AMP, distinguono meglio tra AMP con e senza attività batteriche anti-gram-negative. Ciò implica che essere AMP con attività batteriche anti-gram-negative può preferire o addirittura richiedere una forte anfipatia e una carica netta positiva.

immunomodulazione

Oltre a uccidere direttamente i batteri, è stato dimostrato che hanno una serie di funzioni immunomodulanti che possono essere coinvolte nella clearance dell'infezione, inclusa la capacità di alterare l'espressione del gene ospite, agire come chemochine e / o indurre la produzione di chemochine, inibendo il pro indotto dai lipopolisaccaridi - produzione di citochine infiammatorie, promozione della guarigione delle ferite e modulazione delle risposte delle cellule dendritiche e delle cellule della risposta immunitaria adattativa. I modelli animali indicano che i peptidi di difesa dell'ospite sono cruciali sia per la prevenzione che per l'eliminazione dell'infezione. Sembra che molti peptidi inizialmente isolati come e definiti "peptidi antimicrobici" abbiano dimostrato di avere funzioni alternative più significative in vivo (ad esempio l'epcidina). Dusquetide, ad esempio, è un immunomodulatore che agisce attraverso la p62, una proteina coinvolta nella segnalazione di infezione basata su recettori a pedaggio. Il peptide viene esaminato in uno studio clinico di fase III da Soligenix (SGNX) per accertare se può aiutare a riparare i danni indotti dalle radiazioni alla mucosa orale che si presentano durante la radioterapia del cancro della testa e del collo.

Meccanismi d'azione

I peptidi antimicrobici che possiedono una carica netta positiva sono attratti e incorporati in membrane batteriche caricate negativamente. Una volta all'interno della membrana, si ritiene che causino la distruzione attraverso tre possibili meccanismi:

  • formazione di pori toroidali
  • formazione di tappeti
  • formazione di doghe a botte

Sebbene le specifiche di ciascun meccanismo differiscano, tutte propongono la rottura della membrana indotta da peptidi, consentendo perdite citoplasmatiche che alla fine portano alla morte.

Lavori recenti hanno dipinto un quadro più complesso dell'attività peptidica antimicrobica. I peptidi antimicrobici possono anche funzionare come inibitori metabolici, inibitori del DNA, RNA e sintesi proteica e inibitori della sintesi delle pareti cellulari o della formazione del setto. Sono anche noti per causare aggregazione ribosomiale e delocalizzare le proteine ​​di membrana.

Aggiungendo un ulteriore livello di complessità, molti peptidi antimicrobici naturali possiedono una debole attività battericida. Piuttosto che inibire direttamente la crescita batterica, ora sono noti per agire di concerto con il sistema immunitario ospite attraverso meccanismi quali l'induzione di chemochine, il rilascio di istamina e la modulazione dell'angiogenesi. Questi effetti immunomodulatori hanno iniziato a ricevere attenzione solo di recente.

Sono stati usati diversi metodi per determinare i meccanismi dell'attività peptidica antimicrobica. In particolare, gli studi NMR allo stato solido hanno fornito una spiegazione della risoluzione a livello atomico della rottura della membrana da parte dei peptidi antimicrobici. Negli anni più recenti, la cristallografia a raggi X è stata utilizzata per delineare nei dettagli atomici il modo in cui la famiglia di piante difende le membrane di rottura identificando i fosfolipidi chiave nelle membrane cellulari del patogeno. Si ritiene che le defensine umane agiscano attraverso un meccanismo simile, prendendo di mira i lipidi della membrana cellulare come parte della loro funzione. In effetti, la beta-defensina 2 umana ha ora dimostrato di uccidere i funghi patogeni Candida albicans attraverso interazioni con specifici fosfolipidi.

metodi applicazioni
Microscopia per visualizzare gli effetti dei peptidi antimicrobici sulle cellule microbiche
Spettroscopia di emissione atomica per rilevare la perdita di potassio intracellulare (un'indicazione che l'integrità della membrana batterica è stata compromessa)
Coloranti fluorescenti per misurare la capacità dei peptidi antimicrobici di permeabilizzare le vescicole di membrana
Formazione del canale ionico per valutare la formazione e la stabilità di un poro indotto dal peptide antimicrobico
Dicroismo circolare e dicroismo circolare orientato per misurare l'orientamento e la struttura secondaria di un peptide antimicrobico legato a un doppio strato lipidico
Interferometria a doppia polarizzazione per misurare i diversi meccanismi dei peptidi antimicrobici
Spettroscopia NMR a stato solido misurare la struttura secondaria, l'orientamento e la penetrazione dei peptidi antimicrobici nei doppi strati lipidici nello stato liquido-cristallino biologicamente rilevante
Diffrazione di neutroni e raggi X. per misurare i modelli di diffrazione dei pori indotti dal peptide all'interno delle membrane in multistrati o liquidi orientati

Uso terapeutico

I peptidi antimicrobici sono stati usati come agenti terapeutici; il loro uso è generalmente limitato alla somministrazione endovenosa o ad applicazioni topiche a causa della loro breve emivita. A gennaio 2018 i seguenti peptidi antimicrobici erano in uso clinico:

  • Bacitracin per polmonite, topica
  • Boceprevir, epatite C (orale, peptide ciclico)
  • Dalbavancin, infezioni batteriche, IV
  • Daptomicina, infezioni batteriche, IV
  • Enfuvirtide, HIV, iniezione sottocutanea
  • Oritavancina, infezioni batteriche, IV
  • Teicoplanina, infezioni batteriche, IV
  • Telaprevir, epatite C, peptide ciclico orale
  • Telavancina, infezione batterica, IV
  • Vancomicina, infezione batterica, IV.
  • Guavanin 2, infezione batterica contro Gram-positivi e Gram-negativi anche.

Ricerca

Alcune cecropine (ad es. Cecropina A e cecropina B) hanno proprietà antitumorali e sono chiamate peptidi antitumorali (ACP) .: 3 ACP ibridi basati su Cecropin A sono stati studiati per proprietà antitumorali. peptidi di procarioti, organismi acquatici come pesci e molluschi e monotremi come echidna.

selettività

Nella competizione delle cellule batteriche e delle cellule ospiti con i peptidi antimicrobici, i peptidi antimicrobici interagiranno preferibilmente con la cellula batterica con le cellule dei mammiferi, il che consente loro di uccidere i microrganismi senza essere significativamente tossici per le cellule dei mammiferi. La selettività è una caratteristica molto importante dei peptidi antimicrobici e può garantire la loro funzione di antibiotici nei sistemi di difesa dell'ospite.

Per quanto riguarda le cellule tumorali, esse stesse secernono anche peptidi antimicrobici umani inclusa la defensina e, in alcuni casi, sono più resistenti delle cellule normali circostanti. Pertanto, non possiamo concludere che la selettività sia sempre elevata nei confronti delle cellule tumorali.

fattori

Esistono alcuni fattori strettamente correlati alla proprietà di selettività dei peptidi antimicrobici, tra i quali la proprietà cationica contribuisce maggiormente. Poiché la superficie delle membrane batteriche è caricata più negativamente rispetto alle cellule di mammifero, i peptidi antimicrobici mostreranno diverse affinità con le membrane batteriche e le membrane delle cellule di mammifero.

Inoltre, ci sono anche altri fattori che influenzeranno la selettività. È noto che il colesterolo è normalmente ampiamente distribuito nelle membrane cellulari dei mammiferi come agenti stabilizzanti della membrana ma assente nelle membrane cellulari batteriche; e la presenza di questi colesteroli ridurrà generalmente anche l'attività dei peptidi antimicrobici, a causa della stabilizzazione del doppio strato lipidico o delle interazioni tra colesterolo e peptide. Quindi il colesterolo nelle cellule di mammifero proteggerà le cellule dagli attacchi dei peptidi antimicrobici.

Inoltre, è noto che il potenziale transmembrana influenza le interazioni peptide-lipidi. Esiste un potenziale transmembrana interno negativo esistente dal volantino esterno al volantino interno delle membrane cellulari e questo potenziale transmembrana interno negativo faciliterà probabilmente la permeabilizzazione della membrana facilitando l'inserimento di peptidi caricati positivamente nelle membrane. In confronto, il potenziale transmembranico delle cellule batteriche è più negativo di quello delle normali cellule di mammifero, quindi la membrana batterica sarà soggetta ad essere attaccata dai peptidi antimicrobici con carica positiva.

Allo stesso modo, si ritiene anche che l'aumento della forza ionica, che in generale riduce l'attività della maggior parte dei peptidi antimicrobici, contribuisca parzialmente alla selettività dei peptidi antimicrobici indebolendo le interazioni elettrostatiche richieste per l'interazione iniziale.

Meccanismo

Le membrane cellulari dei batteri sono ricche di fosfolipidi acidi, come fosfatidilglicerolo e cardiolipina. Questi gruppi di fosfolipidi sono fortemente caricati negativamente. Pertanto, i foglietti più esterni del doppio strato che è esposto all'esterno delle membrane batteriche sono più attraenti per l'attacco dei peptidi antimicrobici carichi positivamente. Quindi l'interazione tra le cariche positive dei peptidi antimicrobici e le membrane batteriche caricate negativamente sono principalmente le interazioni elettrostatiche, che è la principale forza motrice dell'associazione cellulare. Inoltre, poiché i peptidi antimicrobici formano strutture con una faccia caricata positivamente e una faccia idrofobica, ci sono anche alcune interazioni idrofobiche tra le regioni idrofobe dei peptidi antimicrobici e la superficie dei fosfolipidi zwitterionici (elettricamente neutri) delle membrane batteriche, che agiscono solo come effetto secondario in questo caso.

Al contrario, la parte esterna delle membrane delle piante e dei mammiferi è composta principalmente da lipidi senza alcuna carica netta poiché la maggior parte dei lipidi con gruppi cerebrali carichi negativamente sono sequestrati principalmente nel lembo interno delle membrane plasmatiche. Pertanto, nel caso delle cellule di mammifero, le superfici esterne delle membrane sono generalmente costituite da fosfatidilcolina zwitterionica e sfingomielina, anche se una piccola porzione delle superfici esterne della membrana contiene alcuni gangliosidi con carica negativa. Pertanto, l'interazione idrofobica tra la faccia idrofobica dei peptidi antimicrobici anfipatici e i fosfolipidi zwitterionici sulla superficie cellulare delle membrane cellulari dei mammiferi gioca un ruolo importante nella formazione del legame peptide-cellula. Tuttavia, l'interazione idrofobica è relativamente debole rispetto all'interazione elettrostatica, quindi i peptidi antimicrobici interagiranno preferenzialmente con le membrane batteriche.

L'interferometria a doppia polarizzazione è stata utilizzata in vitro per studiare e quantificare l'associazione al gruppo di testa, l'inserimento nel doppio strato, la formazione dei pori e l'eventuale rottura della membrana.

Controllo

Sono stati fatti molti sforzi per controllare la selettività cellulare. Ad esempio, sono stati fatti tentativi di modificare e ottimizzare i parametri fisico-chimici dei peptidi per controllare le selettività, tra cui carica netta, elicità, idrofobicità per residuo (H), momento idrofobo (μ) e angolo sotteso dall'elica polare caricata positivamente faccia (Φ). Si ritiene che altri meccanismi come l'introduzione di amminoacidi D e aminoacidi fluorurati nella fase idrofobica rompano la struttura secondaria e quindi riducano l'interazione idrofobica con le cellule di mammifero. È stato anche scoperto che la sostituzione di Pro → Nlys nei peptidi antimicrobici β-turn contenenti Pro era una strategia promettente per la progettazione di nuovi peptidi antimicrobici selettivi a piccole cellule batteriche con meccanismi di azione intracellulari. È stato suggerito che l'attacco diretto della magainina alla superficie del substrato ha ridotto il legame cellulare non specifico e ha portato a un limite di rilevazione migliorato per le cellule batteriche come Salmonella ed E. coli .

Resistenza batterica

I batteri usano varie strategie di resistenza per evitare l'uccisione del peptide antimicrobico. Alcuni microrganismi alterano le cariche superficiali nette. Lo stafilococco aureo trasporta la D-alanina dal citoplasma all'acido teicoico superficiale che riduce la carica negativa netta introducendo gruppi amminici basici. S. aureus modifica anche le sue membrane anioniche tramite MprF con L-lisina, aumentando la carica netta positiva. L'interazione dei peptidi antimicrobici con i bersagli di membrana può essere limitata dal polisaccaride in capsule di Klebsiella pneumoniae . Le alterazioni si verificano nelle specie lipidiche A. Salmonella riducono la fluidità della loro membrana esterna aumentando le interazioni idrofobiche tra un numero maggiore di code aciliche del lipide A aggiungendo miristato al lipide A con 2-idrossimiristato e formando lipide A epta-acilato aggiungendo palmitato. Si ritiene che l'aumento del momento idrofobo ritardi o abolisca l'inserzione del peptide antimicrobico e la formazione dei pori. I residui subiscono un'alterazione delle proteine ​​di membrana. In alcuni batteri Gram-negativi, l'alterazione nella produzione di proteine ​​della membrana esterna è correlata alla resistenza all'uccisione da parte dei peptidi antimicrobici. Hemophilus influenzae non tipizzabile trasporta gli AMP all'interno della cellula, dove sono degradati. Inoltre, H. influenzae rimodella le sue membrane per far sembrare che il batterio sia già stato attaccato con successo dagli AMP, proteggendolo dall'attacco di più AMP. I trasportatori di cassette con legame ATP importano peptidi antimicrobici e la pompa di efflusso a divisione cellulare di nodulazione di resistenza esporta peptidi antimicrobici. Entrambi i trasportatori sono stati associati alla resistenza ai peptidi antimicrobici. I batteri producono enzimi proteolitici, che possono degradare i peptidi antimicrobici portando alla loro resistenza. Le vescicole della membrana esterna prodotte dai batteri Gram-negativi legano i peptidi antimicrobici e li sequestrano lontano dalle cellule, proteggendo così le cellule. Le vescicole della membrana esterna contengono anche varie proteasi, peptidasi e altri enzimi litici, che possono avere un ruolo nel degradare il peptide extracellulare e le molecole di acido nucleico, che se lasciate raggiungere le cellule batteriche possono essere pericolose per le cellule. La segnalazione ciclica di GMP era stata anche coinvolta nella regolazione della resistenza ai peptidi antimicrobici in Pseudomonas aeruginosa

Mentre questi esempi mostrano che la resistenza può evolversi naturalmente, c'è una crescente preoccupazione che l'uso di copie farmaceutiche di peptidi antimicrobici possa far sì che la resistenza avvenga più spesso e più velocemente. In alcuni casi, la resistenza a questi peptidi usati come farmaci per trattare problemi medici può portare alla resistenza, non solo all'applicazione medica dei peptidi, ma alla funzione fisiologica di quei peptidi.

L'approccio del "cavallo di Troia" per risolvere questo problema fa leva sull'innato bisogno di ferro da parte dei patogeni. Il "contrabbando" di antimicrobici nell'agente patogeno si ottiene collegandoli ai siderofori per il trasporto. Sebbene di concezione semplice, ci sono voluti molti decenni di lavoro per realizzare il difficile ostacolo del trasporto di antimicrobici attraverso le membrane cellulari dei patogeni. Sono state riviste le lezioni apprese dai successi e dai fallimenti dei farmaci coniugati al sideroforo valutati durante lo sviluppo di nuovi agenti usando l'approccio del "cavallo di Troia".

Esempi

I peptidi antimicrobal sono prodotti da tutte le specie conosciute, compresi i peptidi da batteri, funghi, idra, insetti (mastoparan, poneratossina, cecropina, moricina, melittina e altri), rane (magainina, dermaseptina e altri), aviaria (ad esempio, cathelicidin e defensine) e mammiferi (ad esempio, cathelicidins, defensins e protegrins). La ricerca è aumentata negli ultimi anni per sviluppare imitazioni artificiali di peptidi antimicrobici come gli SNAPP, in parte a causa del costo proibitivo di produzione di AMP di origine naturale. Un esempio di questo è il peptide cationico facciale C18G, che è stato progettato dal dominio C-terminale del fattore piastrinico umano IV. Attualmente, il peptide antimicrobico più utilizzato è la nisina; essendo l'unico peptide antimicrobico approvato dalla FDA, è comunemente usato come conservante artificiale.

Bioinformatica

Esistono diversi database bioinformatici per catalogare i peptidi antimicrobici come ADAM (A Database of Anti-Microbial peptides), APD (Antimicrobial Peptide Database), BioPD (Biologically Active Peptide Database), CAMP (Raccolta di sequenze e strutture di peptidi antimicrobici), DBAASP ( Database di attività antimicrobica e struttura dei peptidi) e LAMP (Linking AMPs).

I database dei peptidi antimicrobici possono essere suddivisi in due categorie sulla base della fonte dei peptidi che contiene, come database specifici e database generali. Questi database hanno vari strumenti per l'analisi e la previsione dei peptidi antimicrobici. Ad esempio, CAMP contiene previsioni AMP, calcolatrice di funzioni, ricerca BLAST, ClustalW, VAST, PRATT, ruota elicoidale, ecc. Inoltre, ADAM consente agli utenti di cercare o navigare tra le relazioni struttura-sequenza AMP. I peptidi antimicrobici spesso comprendono una vasta gamma di categorie come i peptidi antimicotici, antibatterici e antitubercolari.

Strumenti come PeptideRanker, PeptideLocator e AntiMPmod consentono di prevedere i peptidi antimicrobici mentre altri sono stati sviluppati per prevedere le attività antifungine e antitubercolari.